石墨烯及其衍生物被誉为“奇迹”材料，在电子、储能、医药等社会各个领域有着广泛的应用。谈石墨烯的安全性，有些读者可能感觉到奇怪，但如果有一天石墨烯真的被大规模应用，它将无处不在。随着各类石墨烯基材料(GBMs）被不断开发，其对人类健康和环境的潜在影响一直缺乏合理的综合评价。有鉴于此，瑞典环境医学研究所Bengt Fadeel，曼彻斯特大学Cyrill Bussy，的里雅斯特大学Maurizio Pra教授和法国斯特拉斯堡大学Alberto Bianco等26位海外学者联名在国际顶级期刊《ACS Nano》上发表综述文章。在本文中，作者讨论了GBMs材料的合成和表征，并且使用体外和体内模型系统评估GBMs对人类和环境的危害，解开了GBMs材料的结构-活性关系。

石墨烯是首个被发现的二维原子晶体，具有许多超凡的性能，如机械刚度、强度和弹性，以及高电导率和热导率，其衍生物目前也拥有多种不同的应用。安全与可持续发展石墨烯技术和产品需要密切关注材料对人类健康和环境的潜在影响，事实上，安全评估是材料走向应用的一个重要组成部分。

材料表征是危害评估的关键要素，碳纳米管的毒理学评估就是一个很好的例子——碳纳米管在某种程度上作为病原纤维，对人类具有潜在致癌性。当然，如果适当纯化并加以表面修饰，碳纳米管在纳米医学，例如药物或基因传递和/或成像方面具有广阔的前景。从以往的经验教训来看，如果我们承认新材料具有有用的特性，我们就必须承认，这种新材料可能带来新的或未预料到的风险。这并不是说新材料的生物或毒理效应必然是“新奇的”，但我们需要了解这些材料的特性以及它们如何与生物效应相互作用，以便使它们既实用又安全。

【GBMs的合成与表征】

石墨烯研究中的一个重要问题是， “石墨烯”作为术语可以描述许多不同的GBM。为了补救这种情况，Graphene旗舰公司提出了一个GBM的分类方案，考虑三个关键参数：石墨烯层数、平均横向尺寸和碳氧原子比(C:O)。使用这种分类可促进不同实验室在研究之中的比较。

Figure1.石墨烯材料的分类.

GBMs的合成

虽然文献中有许多关于不同石墨烯合成方法的报道，但是当材料用于生物应用包括毒理学评价时，需要满足某些特定要求。一般来说，对于体外研究，材料必须在水溶液中稳定分散，并且杂质的量应仔细控制，因为生产通常不在无菌条件下或使用无菌溶剂进行，所以除了合成过程中产生的化学污染物外，还需要考虑生物污染物，即微生物或部分微生物(内毒素)的影响。常见获得GBM用于生物应用的方法有：

1. 超声剥离法；为了成功地在水中剥离，通常使用层间的小分子或溶剂的辅助插层。比如Liu et al.采用过硫酸铵或过氧化氢插层法，在微波辐照下使石墨剥落，制备出高质量的多层石墨烯。

2. 氧化石墨烯(GO)；大多数合成GO的方法是基于石墨氧化，也就是著名的Hummers法，其中包括使用氧化试剂和酸。这种方法会产生不同程度的氧化和杂质，必须引入额外的纯化步骤以提高材料的纯度。

3. 还原氧化石墨烯(rGO)；获得rGO的代表方法包括GO的化学、热和电/光化学还原。化学还原法优于非化学还原法，因为提高了质量、效率和可以获得稳定的rGO分散液。最有效的化学还原剂是肼，然而，这种试剂不是很受欢迎，因为它对人类和环境具有毒性。

尽管上面讨论的大多数合成方法都获得了高质量的石墨烯，但是这些方法无法定标，限制了它们的工业应用。因此，以简单和低成本的方式获得大量的生物相容性石墨烯仍然是一个相当大的挑战。

GBMs的表征

为了进行适当的危险评估，需要使用标准化的技术对材料进行良好表征。对于化学表征，最常用的技术是XPS、FT-IR、Raman、XRD、TGA和元素分析，TEM、SEM和AFM提供了材料的形态和尺寸的信息，阿米巴裂解液(LAL)检测通常用于检测纳米材料和生物材料中的内毒素含量。值得注意的是，即使使用普适性方法制备出石墨烯材料(例如，GO)，最终产品通常也不是均匀的，而是具有不同性质的组分广泛分布。通常，GBMs的毒性（或安全性）取决于物理化学性质，如大小、层数和表面化学性质，此外，杂质的存在和所使用的石墨烯合成方法也可能影响毒理学反应。

FigureS1.根据石墨烯层数、平均横向尺寸、原子碳/氧比三个基本性质对最近石墨烯研究中使用的GBM材料进行分类.

材料属性的作用：参考数据库

为了剖析（纳米）材料特性在生物学影响方面的作用，应该考虑访问适当的参考数据库。2009年，Nel提议建立一个标准的纳米材料数据库，包括纳米材料和纳米颗粒的主要类别，他的原话是“it is important to linkthe library development to a nanomaterial classification that allows toxicologicalmechanisms to be interpreted in terms of intrinsic material properties”。从那时起，出现了一些数据库，Zhou et al.开发了80个功能化碳纳米管的组合数据库，以揭示与细胞毒性和免疫应答有关的结构-活性关系。石墨烯与碳纳米管和富勒烯一起被包含在纳米碳的家族中。然而，我们认为，由于石墨烯的化学结构与纳米管和富勒烯的化学结构显著不同，因此化学成分不是人们应该考虑的唯一参数。

【石墨基材料的生物分布】

GBMs在暴露有机体中的命运受其内在物理化学特征(如横向尺寸、厚度和C:O比/官能化)以及它们与生物环境接触时的外在或后天获得的特征的支配，此外，进入身体的入口也是物质随后命运的主要决定因素。GBMs的内在特征可影响其生物分布、向次生器官的转移、积累、降解和清除，然而，这些特性可能由于生物环境中存在的蛋白质和其他生物分子的吸附而改变。值得注意的是，随着GBM从一个生物隔室移动到另一个生物隔室（例如，从肺部移动到血流），这些获得的特征可能随时间动态变化，并随着局部环境的变化而演变。然而，由于免疫细胞或其他形式的生物转化的降解，固有材料特性也会发生变化。

石墨烯基材料的多种染毒途径

为了探讨口服给药的影响，Zhang et al.采用125I标记的小和大（两种纳米级）rGO片在口腔灌胃后60天内的生物分布，这两种物质都存在于血液、心脏、肺、肝脏和肾脏中，肾脏中的含量在第一天显著高于对照组，随后迅速减少，但在第15天和第60天仍高于对照组，这些结果表明，两种物质在胃肠道内迅速被吸收，并通过体循环到达次级器官。Li et al.采用125I标记的纳米GO（横向尺寸：10-800nm，1-2层）测定气管内灌注后的生物分布，绝大多数的GO在肺中发现，在血液、肝脏和肾脏中也检测到少量。这些结果归因于直接从肺或通过肠道吸附向血液的转移，因为大量物质也可在胃和肠中检测到，可能是由于粘液毛清除、吞咽和再分布到胃肠道。

纳米安全与药物的桥接：静脉给药

纳米材料在生物医学应用中最常见的给药途径之一是静脉(IV)途径，纳米医学中大量的研究和开发工作已经证实，形状、尺寸和表面电荷是决定纳米材料在静脉注射后的生物分布和命运的最重要的物理化学参数。

Figure2.GO的生物分布. [64Cu]-f-GO-thin, [64Cu]-f-GO-thick和[64Cu]-EDTA的PET/CT表征结果和组织分布.

总的来说，证据表明GBM能够跨越生理屏障，到达远离进入点的次级器官，然而，由于缺乏已发表的数据和缺乏系统的调查，就GBM的物理化学特征和生物分布模式之间的关系得出确定的结论还为时过早。

【石墨基材料的危险性评估】

纳米材料可以通过不同的途径进入人体，而吸入、皮肤吸附和摄取是最有可能在环境中意外感染的途径，在某种程度上，这些物质在特定靶器官的水平上表现出它们的生物学（或毒理学）效应。

石墨烯基材料的免疫相互作用

免疫系统由复杂的分子和细胞网络组成，它们保护我们的身体免受感染和其他外源物质的侵害，同时保持对自身成分的耐受性。在新材料的开发中，评估它们对免疫系统的影响是至关重要的，以便了解这些材料的存在是否能够被处理，或者弄清这些材料的持续存在是否会引起慢性疾病。巨噬细胞是固有免疫系统的关键细胞，其作用是清除外源性和内源性物质，因此，探究GBMs是否影响巨噬细胞的存活和/或活化是非常重要的。

Figure3.巨噬细胞摄取GO的过程.

巨噬细胞属于病原体或外来物质的天然免疫防御的前线，大多数关于巨噬细胞的研究都是用巨噬细胞样细胞系或单核细胞来源的巨噬细胞来完成的，然而，肺泡巨噬细胞连同上皮细胞，在肺部暴露后与到达肺部的GBM相互作用。

由于石墨烯的疏水性太强，在水溶液中不能得到均匀的分散体，因此必须使用合适的生物相容性表面活性剂或涂覆分子。高通量技术彻底改变了免疫细胞的分析及其复杂的相互作用，因此，只有通过采用系统生物学方法和高通量工具，才能够对免疫系统如何与纳米材料相互作用进行全面的分析，从而能够对细胞类型、细胞激活状态和可溶的刺激/抑制介质进行多重分析。

Figure4.用单细胞质细胞仪分析石墨烯的免疫影响.

总的来说，当对GBMS的不同研究结果进行比较时，发现与碳纳米管的作用相比，这类材料对巨噬细胞的毒性似乎不太明显。

石墨烯基材料的生物降解

纳米材料的生物降解是毒理学和纳米医学的一个相当重要的课题，一些碳基纳米材料，如单壁碳纳米管，很容易被免疫细胞降解。虽然在这方面已经对GBM做了一些研究，但是描述每个生物降解研究中使用的不同材料的结构特征使结果不太合理。Kotcheyet al.发现低浓度过氧化物酶(HRP)可降解GO，而rGO则不受影响，该文章评价了三种横向尺寸和碳氧比相近，但厚度不同的GO，在24h时，两种高度分散的材料完全或几乎完全降解，而聚集的样品仅发生有限的结构变化。

石墨烯基材料对皮肤的影响

皮肤是人体和环境之间的主要屏障，它可以被认为是GBMs最重要的暴露部位之一，尤其是在环境中，考虑到GBMs的化学性质，皮肤刺激可以被认为是皮肤暴露后最可行的结果。然而，不能根据GBMs与蛋白质相互作用的倾向排除皮肤致敏作用，事实上，皮肤接触相关材料如石墨和碳纳米管，很容易形成皮肤疾病，如接触性皮炎。

石墨烯基材料对肺的影响

在环境中无意接触纳米材料的不同途径中，吸入是最受关注的途径，关于空气污染和超细颗粒对人类肺部健康的影响的长期研究支持了纳米和微米颗粒可能对肺部造成损害的观点。经过长期的研究，科学家发现肺感染的程度与被测材料的特定理化性质直接相关，尺寸似乎再次成为GBMs生物反应的重要驱动力。值得注意的是，迄今为止只有少数研究报告在肺部暴露于GBMs后诱导纤维化，当GBMs与致病性多壁碳纳米管进行比较时，肺纤维化的缺乏是一个重要的差异。

石墨烯基材料对心血管的影响

在过去的20年里，有大量的证据表明空气污染、吸入细微粒和超细微粒引起心血管疾病，吸入颗粒物引起的肺系统的炎症和氧化应激被认为是对心血管系统产生副作用的可能原因。心血管疾病的发生可以和肺部感染之间联系起来，但当前的研究都不太系统，缺乏合理的结论。

石墨烯基材料对胃肠道的影响

胃肠（GI）系统使人体能够摄取食物，消化食物和必需微量元素，以及排出粪便；口腔暴露处潜在的纳米材料有两个主要来源：i)食品中直接摄入的物质或从食品包装中释放出来的物质；ii)吸入材料的间接摄入。大部分吸入的纳米材料被困在呼吸系统，并通过粘液纤毛向上输送，最后被吞下或咳嗽出来，而进入胃肠道的纳米材料随之暴露于唾液中。消化酶、pH值、离子强度、表面活性化合物和食物摄取量等若干因素有可能改变纳米材料的理化性质，因此在口服GBMs纳米材料的危害评估中必须考虑这些因素。

Figure5.碳基纳米材料与肠道微生物.

在这个相对较新的领域进行的首次探索性研究显示，几种不同的GBM对肠上皮细胞没有或仅有轻微的急性细胞毒性，然而，该领域还处于起步阶段，GBMs的长期影响，包括对微生物的影响，至今仍未得到答案。

石墨烯基材料对生殖和发育的影响

孕妇、胎儿和新生儿是最脆弱的人群，因此在GBM危险评估方面值得特别关注，在怀孕期间，发生的生理变化会影响颗粒动力学和随后的生物效应，且由于生理变化或免疫系统的不成熟，发育中的胎儿和新生儿比成人更容易受到外来生物的毒性作用。

石墨烯基材料对中枢神经系统的影响

石墨烯在神经科学中具有令人振奋的前景，其独特的物理化学性质，如高导电性、透明性或柔韧性，使得它成为设计具有优异神经调节治疗的有吸引力的候选材料，也是中枢神经系统（CNS）损伤的神经再生的必要条件。神经病学是按需释放药物，从而能够精确定向给药以满足不同治疗应用的要求，基于石墨烯的多功能神经装置是通过注射或植入将脑细胞和神经元回路直接暴露，因此石墨烯及其衍生物的安全性评估是至关重要的。

Figure6．石墨烯与神经元的相互作用.

Figure7．石墨烯对神经元通讯的调结.

【石墨基材料的环境危害评估】

虽然纳米技术领域获得了巨大进步，但纳米技术对环境影响的理解依然进展缓慢，大规模生产、从富集产物中浸出、工业生产中的意外溢出以及衍生废物的不良处置可能导致环境中GBMs的显著释放和累积。这种现象已经出现在其他合成材料上，例如塑料，它们被发明者和生产者誉为“世纪发现”，并被正确地预测为改变人们的日常生活，然而，尽管承诺实现了，但不幸的是，意外的环境问题抵消了这些好处，而且这些问题是在半个世纪之后才以引人注目的方式出现。因此，探索GBMS的生态毒性具有十分重要的意义。

石墨烯基材料对细菌的影响

研究碳基纳米材料对细菌的影响是至关重要的，因为它们是环境中营养链的基础，涉及营养循环的许多阶段，并与其他生物有复杂的联系，与其他生物系统相比，GBMs对细菌的影响研究相对比较系统。

石墨烯基材料对光合生物的影响

近年来，从蓝藻到种子植物，科学家对各种模型和非模型光自养菌进行了GBMs的生态毒性评价。

石墨烯基材料对种子植物的影响

作为初级生产者，种子植物是所有陆地生态系统的基本组成部分，空气分散的GBMs最终会以湿或干沉积形式沉降在植被上，从而到达土壤，种子植物通过食物链将吸收的纳米材料转移到生物群。因此，在不同生长阶段，从种子到幼苗，GBMs对种子植物的影响已经被研究，在成年植物中更罕见，但通常从细胞培养开始。

石墨烯基材料对无脊椎动物的影响

水生和陆生无脊椎动物很可能暴露于碳基纳米材料中，对于地面效应，大多数研究是用蠕虫进行的，特别是线虫线虫秀丽隐杆线虫，这是一种适合于力学研究的模型系统。在水生环境中，生活在水柱中的远洋物种和生活在沉积物附近或内部的底栖物种会自然地受到碳基纳米材料的影响，这取决于它们对远洋/底栖生物的生物利用度。影响纳米材料在环境中的行为的一个重要因素是天然有机材料的存在，这类天然有机材料在自然水环境中普遍存在，比如多糖、脂类、蛋白质及其他有机材料。

石墨烯基材料对脊椎动物的影响

生态毒理学中研究最多的脊椎动物是水生幼鱼和两栖类幼虫，在鱼类中，斑马鱼（Danio rerio）模型具有很好的代表性，作为远洋脊椎动物，尽管在体内观察到广泛的生物分布，但是它们可能从胚胎阶段就表现出对碳基纳米材料的抗性。在胚胎中，GO可以与绒毛膜结合，导致缺氧和孵化显著延迟，并且观察到轻微的细胞生长抑制（没有明显的凋亡诱导）。对两栖类幼虫(Ambyst.mexicanum)进行的研究表明，尽管消化道中大量摄入碳基纳米材料，但未观察到死亡率或生长抑制或任何遗传毒性。

Figure8.小层石墨烯、纳米金刚石、双壁或多壁碳纳米管对爪蟾幼虫生长抑制作用的研究.

Figure9.石墨烯生产的生命周期分析，以化学还原法（CRR）和超声法（USR）为主.